中红外激光光谱同时定量母乳四种蛋白，揭示巴氏消毒的“选择性损失”

人乳蛋白质对婴儿生长发育及免疫防御至关重要。当亲母母乳不足时，捐赠人乳需经 Holder 巴氏消毒（62.5 °C, 30 min），但热处理可能影响蛋白结构与功能。传统蛋白检测方法（如凯氏定氮、Bradford、ELISA、高效液相色谱等）或只能测定总蛋白，或操作繁琐、易受基质干扰，难以满足临床快速、多组分分析的需求。

一项发表于《Current Research in Food Science》的研究，利用外腔量子级联激光器（EC-QCL）中红外光谱技术，成功实现了对人乳及捐赠人乳中四种蛋白的同步快速定量。该方法无需复杂前处理，单次分析仅需数分钟，为母乳库的质量控制与个性化营养支持提供了新工具。

技术原理与系统搭建

研究采用的EC‑QCL光源可在1350–1770 cm⁻¹波数范围内连续扫描，该区间恰好覆盖蛋白质的酰胺I带（约1600–1700 cm⁻¹）和酰胺II带（约1500–1560 cm⁻¹）。液态样品通过一个25 μm光程的透射流通池，采集到的光谱经导数预处理后，利用偏最小二乘（PLS）回归建立各蛋白的定量模型。

图1：(A) 2 g·L⁻¹ α‑乳白蛋白、乳铁蛋白和酪蛋白的激光红外光谱。(B) 不同稀释度（即 20%、50% 和 80% 人乳）的人乳中分别加入 α‑乳白蛋白（0.9 g·L⁻¹）、乳铁蛋白（1.0 g·L⁻¹）和酪蛋白（1.0 g·L⁻¹）后测得的激光红外光谱。

为解决母乳基质干扰，该团队采用“基质匹配校准”策略——将α‑乳白蛋白、乳铁蛋白和牛源酪蛋白的标准品直接加入不同稀释度的人乳中，构建校正集。α‑乳白蛋白和乳铁蛋白模型选用酰胺I区（1700–1600 cm⁻¹）光谱，而酪蛋白和总蛋白则利用更宽的1755–1350 cm⁻¹波数区间，以提取更全面的化学信息。

模型验证：

用留一法进行内部交叉验证，解释方差 ≥84%，RMSECV ≤0.25 g·L⁻¹，表明模型具有良好的稳定性。特别是总蛋白模型，R²达到了0.997，误差只有0.15 g/L。

在49份独立样本的外部验证中，EC-QCL预测值与反相高效液相色谱（RP‑HPLC）及凯氏定氮法的参考值进行了系统比较（见图2）。

回归分析表明，四种蛋白的斜率均不显著偏离1（95% CI包含1），截距均不显著偏离0（95% CI包含0）说明方法无系统偏差；Bland‑Altman偏差评估中，总蛋白偏差0.20 g/L，α‑乳白蛋白偏差0.21 g/L，乳铁蛋白偏差0.07 g/L，证实了技术的准确性。酪蛋白的预测误差稍大，主要归因于采用牛源酪蛋白替代人乳酪蛋白作为标准带来的结构差异，且外部验证样本量较小（仅生乳）（见图2）。

图2：α‑乳白蛋白（A）、乳铁蛋白（B）、酪蛋白（C）和总蛋白（D）的回归分析（上）与 Bland‑Altman 图（下），比较参比方法（α‑乳白蛋白和乳铁蛋白采用 HPLC‑UV 分析，酪蛋白和总蛋白采用凯氏定氮分析）与 EC‑QCL 光谱所得浓度。注：CI，95% 置信区间；LLA，一致性下限；ULA，一致性上限。

结果与讨论—— 276份实际样本揭示的生理与加工规律

泌乳期蛋白动态变化：从哺乳初期（实现完全肠内营养或恢复出生体重算起）到约1个月，母乳中蛋白质浓度快速下降，随后趋于平稳（图3）。这一规律在早产乳与足月乳中均被观察到，提示母乳蛋白含量在适应婴儿生长的过程中呈现动态调整。

早产与足月乳蛋白含量对比：尽管早产母乳的蛋白浓度中位数略高于足月乳，但差异未达到统计学显著性（p > 0.05）（图3），说明单纯依靠早产状态并不能可靠预测蛋白水平，个体化评估仍然必要。

图3：早产儿母亲（蓝色）与足月儿母亲（黑色）母乳在产后前六个月的 α乳白蛋白（左上）、乳铁蛋白（右上）、酪蛋白（左下）和总蛋白（右下）含量。注：CEN 指早产儿达到完全肠内营养（>150 mL/kg/天）的时间点；RBW 指足月儿恢复出生体重的时间点。红色叉号表示均值。p < 0.001；*p < 0.05，Wilcoxon 秩和检验。

Holder巴氏消毒的“选择性”破坏：研究最为引人注目的发现之一，是62.5 °C、30 min的Holder消毒对各类蛋白的影响极不均衡。在37对配对的生乳与巴氏消毒乳中，总蛋白和酪蛋白仅损失约3%，而具有重要免疫和消化功能的乳清蛋白损失严重：α‑乳白蛋白平均下降24%，乳铁蛋白下降14%（图4）。这一结果意味着，当前广泛采用的巴氏杀菌工艺在确保微生物安全的同时，显著降低了母乳的免疫保护潜能。

光谱直接区分生乳与巴氏消毒乳：基于光谱数据的偏最小二乘判别分析（PLS‑DA）能够有效区分生乳和巴氏消毒乳，其交叉验证的受试者工作特征曲线下面积（AUROCCV）表现优异（图4），证明光谱本身可作为加工痕迹的“指纹”，为乳库提供了一种无试剂、非接触的质控新路径。

图4：（A）配对生乳（DHM‑Pre）与巴氏消毒乳（DHM‑Post）样品基于激光红外光谱的均值与标准差（每组 N=34）；（B）基于激光红外光谱的 DHM‑Pre 与 DHM‑Post 样品 PLS‑DA 得分图（二阶导数 + 均值中心化，2 个潜变量）；（C）基于 EC‑QCL 红外光谱的 DHM‑Pre 与 DHM‑Post 样品交叉验证（CV）预测结果（p<0.01，Wilcoxon 秩和检验）；（D）基于 EC‑QCL 红外光谱的 PLS 模型所预测的 DHM‑Pre 与 DHM‑Post 样品中 α‑乳白蛋白、乳铁蛋白、酪蛋白和总蛋白的浓度。注：红色虚线表示判别阈值；AUROCCV，交叉验证受试者工作特征曲线下面积。

结论与展望

该研究证实了EC‑QCL中红外光谱作为母乳蛋白快速分析工具的潜力，其分析速度快、不破坏样品，且能同时提供多种蛋白信息，有望嵌入母乳库的日常检测流程，也为大规模母乳肽组学/蛋白组学研究提供了技术基础。然而，将这一平台推向常规应用仍需克服若干障碍：首先，酪蛋白模型需引入人乳源酪蛋白标准品以提高预测准确性；其次，冷冻贮存、反复冻融等额外加工因素对蛋白含量及光谱响应的影响尚需系统评估；此外，当前仪器成本和体积仍是临床普及的制约因素。

总体而言，EC‑QCL光谱已经证明其可在几分钟内完成对母乳蛋白组的多组分定量，特别是在识别巴氏消毒造成的功能性蛋白损失方面展现了独特价值。随着硬件小型化与标准品完善，这一技术有望成为新生儿精准营养支持的有力工具。

参考文献：

Ten-Doménech I, Vijayakumar S, Schwaighofer A, et al. Laser-based mid-IR spectroscopy as a rapid analytical technique for the quantification of human milk proteins. Current Research in Food Science, 2026, 13: 101492.