导语

治疗性蛋白是当前药物开发中增长最快的类别之一，全球约有1400个候选分子处于临床阶段。这类分子的结构复杂，其质量、安全性和有效性需要通过一系列关键质量属性（CQAs）的评估来保障。传统的蛋白鉴定通常需要分别进行氨基酸测序和糖谱分析，样品处理繁琐、耗时长，且难以在完整蛋白状态下同时获取多维结构信息。

近期，Applied Spectroscopy 发表了一项新方法研究，提出了一种基于量子级联激光（QCL）红外显微光谱与双迹二维相关光谱（2T2D）技术的平台化方案。该平台利用QCL光源的高亮度特性，在宽场透射模式下快速采集高信噪比的高光谱图像，可在单一实验中完成蛋白身份确认与多项关键质量属性的并行评估。

平台搭建

该方法的核心硬件为QCL红外显微光谱系统（ProteinMentor），其主要特点包括：

l 四台宽调谐外腔量子级联激光器，覆盖1775–1015 cm⁻¹光谱范围，同时涵盖酰胺I/II带和糖链特征区域；

l 宽场透射成像设计，单次成像可采集223,000条光谱，视场达2×2 mm²，像素分辨率为4.25×4.25 μm²，信噪比显著优于传统FT-IR显微镜；

l 创新的氟化钙（CaF₂）滑片细胞阵列，固定光程7.94±0.71 μm，每孔仅需1 μL样品；

l 精确温控附件，在24±0.3 ℃下维持热平衡，确保光谱数据的稳定性。

样品无需酶解、纯化或标记，直接在配方缓冲液中检测完整抗体分子。光谱数据采集后，通过2T2D异步相关算法计算加权吸光度差异，从交叉峰中提取分子层面的差异信息。

实验设计与结果

研究选取了4个临床前单克隆抗体候选分子进行两两比对，包括一个参照抗体（reference mAb）和三个变异体（mAb1、mAb2、mAb3）。所有分子具有相同的IgG骨架，但在酰胺II带和糖链区域存在不同程度的差异。为进一步定量解析这些差异，研究采用2T2D异步相关分析，从以下四个维度展开评估。

1. 溶剂可及表面积（SASA）

通过监测表面暴露的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）侧链在1760–1700 cm⁻¹区域的C=O伸缩振动，评估其与水环境的氢键状态。结果显示，参照抗体在双氢键结合状态下的SASA最高，mAb2最低。这一差异与分子的表面暴露程度直接相关。

SASA相关柱状图，汇总β-turn（1692、1688 cm⁻¹）和random coil（1643 cm⁻¹）区域中表面暴露Asp/Glu残基的加权吸光度差异。柱状图显示参照mAb具有最高的SASA，其次为mAb3 > mAb1 > mAb2。

2. 二级结构

在酰胺I带（1700–1600 cm⁻¹）区域，研究定量比较了β-turn、β-sheet、random coil和π-helix的相对含量。参照抗体与mAb1的差异最为显著：参照抗体具有更高的β-turn含量，而mAb1则偏向random coil和anti-parallel β-sheet。

3. 氨基酸组成

在酰胺I/II带区域，2T2D交叉峰可识别多种氨基酸侧链振动模式，包括Gln、Asn、His、Asp、Glu、Tyr和Trp等。该方法成功检出了Asp→Tyr和Asp→Glu的氨基酸替换，且灵敏度足以识别单氨基酸位点变异。

二级结构与氨基酸组成差异的柱状图。(a) 二级结构与侧链相互作用的差异，(b) 氨基酸组成差异。颜色标识：mAb2 vs mAb1（绿色），mAb2 vs mAb3（橙色），参照mAb vs mAb1（蓝色）。

4. 糖基化程度

糖基化程度评估的2T2D相关图与QCL红外显微光谱叠加图（糖链区域，24°C）。(a, c, e, g) 全光谱区域（1775–1015 cm⁻¹）的2T2D异步图；(b, d, f, h) 糖链区域（1136–1015 cm⁻¹）的基线校正光谱。(a, b) 参照mAb与自身，(c, d) mAb2与mAb1，(e, f) mAb2与mAb3，(g, h) 参照mAb与mAb1。图(a)中异步图无交叉峰，表明参照mAb与自身的糖基化程度一致。

在1176–1015 cm⁻¹的糖链特征区域，研究通过C–O–C糖苷键、葡萄糖/半乳糖的C–O环振动以及唾液酸末端N-乙酰基的振动模式，直接比较了糖基化差异。关键发现包括：

l mAb2与mAb3的糖基化谱高度一致；

l mAb1的糖基化程度显著高于mAb2，尤其在半乳糖（1040、1058 cm⁻¹）和唾液酸末端（1047 cm⁻¹）含量上；

参照抗体与mAb1之间同样存在明显的糖谱差异，提示细胞培养条件可能导致糖基化修饰的不同。

方法优势

与传统LC-MS方法相比，该QCL-2T2D平台的突出特点在于：

l 样品处理极简：无需酶解、纯化或标记，直接检测完整蛋白；

l 多属性并行：单次实验同时覆盖二级结构、SASA、氨基酸组成和糖基化程度；

l 高灵敏度与高选择性：QCL光源的高亮度配合2T2D异步谱，可有效分辨高度相似光谱中的微弱差异；

l 适用于配方条件：可在实际制剂缓冲液中评估，结果更具工艺相关性；

l 快速筛选：适用于早期候选分子筛选和放行检测，有助于缩短开发周期。

应用前景

作者指出，该方法不仅限于单克隆抗体，也可扩展至其他治疗性蛋白的评估。此外，平台还可用于监测聚集、降解（如Asn/Gln脱酰胺和氧化）等工艺相关杂质。在生物制药领域，这种能够在药物全生命周期内实施的快速筛选工具，对于降低开发风险、加速上市进程具有明确的实际价值。

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l 窄光谱输出：提供非常窄的光谱输出，满足高光谱分辨率的应用需要。

l 快速波长调谐：在QC芯片的整个增益带宽上（数百cm-1），实现超10ms的快速波长调谐。

l 低损耗元件：使用低损耗元件，使设备可以在便携式电池供电的条件下高效运作，适合便携式应用。

l 高输出功率：相较于DFB-QCL，可提供更高的输出功率，同时保持较窄的光谱宽度。

l 波长可调谐性：覆盖4-12µm的超宽光谱范围，为固体和液体样品分析提供可能。

l 高可靠性：能够提供高可靠性的激光输出，适用于需要稳定光源的应用。

l 室温工作能力：在室温下运行，无需额外的冷却系统，实现了设备的小型化和便携化。

文献信息

Pastrana B, Nieves S, Canto EI. Two-Trace Two-Dimensional Correlation Analysis for the Confirmation of Therapeutic Protein Identification and Evaluation of Extent of Glycosylation: A Rapid Method for Testing Critical Quality Attributes. Applied Spectroscopy. 2026. DOI: 10.1177/00037028261451288

https://sage.cnpereading.com/doi/10.1177/00037028261451288