EC-QCL楔形多光程中红外光谱：突破水溶液蛋白质检测的动态范围瓶颈

文献来源：Riedlsperger L., Dabrowska A., Gazizov I., Lendl B., Ramer G. Multi-Pathlength Mid-IR Spectroscopy of Proteins in Aqueous Solutions Using an External Cavity Quantum Cascade Laser. Applied Spectroscopy, 2024. DOI: 10.1177/00037028241308478 (Open Access)

一、背景

中红外透射光谱是解析蛋白质二级结构的经典手段，酰胺I带（~1650 cm⁻¹）和酰胺II带（~1550 cm⁻¹）对α-螺旋、β-折叠等构象高度敏感。然而，在水溶液中开展蛋白质测量时，一个根本性的物理矛盾长期制约着该技术的应用：

本研究提出了一套创新的多光程中红外光谱系统，通过三个核心组件的协同设计，首次实现了无需机械调节的动态光程选择，成功获取了水溶液中蛋白质的高质量中红外光谱。

二、技术突破

（1）楔形多光程流通池

多光程透射流通池示意图。(a) 流通池的CAD渲染图，展示了楔形腔体设计：底部为PTFE垫片（提供最小光程7.4 μm），顶部与梯形凹槽形成楔形腔，光程沿水平方向连续增加~450 μm，最大光程达457.4 μm；(b) 流通池实物照片，两个锗（Ge）窗片夹持楔形腔，窗片外侧镀有增透膜以减少干涉条纹。

流通池的核心创新在于其楔形几何设计：

l 最小光程：由50 μm厚PTFE垫片界定，实测为7.4 μm（垫片压缩后）；

l 最大光程：楔形腔在水平方向提供额外的~450 μm光程增量，总最大光程达457.4 μm；

l 光程连续变化：沿水平方向，光程从7.4 μm连续增加至457.4 μm，无需任何机械移动即可在一帧测量中同时获取多种光程下的光谱信息。

这一设计的物理基础是：EC-QCL的高SPD使激光束能够穿透数百微米的水层仍保持足够的透射强度，而传统Globar在同样条件下几乎无法产生可检测信号。

（2）256元线性热释电探测器阵列

系统采用256元素LiTaO₃热释电线性阵列作为探测器，每个探测单元尺寸为42 × 500 μm，中心间距50 μm，总宽度12.8 mm。该阵列水平放置在楔形流通池后方，使得：

l 每个探测器元素对应一个特定的透射光程——从左到右，光程从7.4 μm单调增加至457.4 μm；

l 单次EC-QCL波长扫描即可同时获取256个不同光程下的透射光谱——无需移动流通池或更换垫片；

l 垂直方向的大探测面积（500 μm）确保了足够的集光效率，补偿了长光程下的信号衰减。

探测器的响应时间为~40 ms，与EC-QCL的扫描速度相匹配。探测器窗片采用锗（Ge）材料（1 mm厚，双面增透膜），既保护了探测器芯片，又作为红外透光窗口。

（3）光程-噪声比（PNR）加权算法

获取256个光程的原始光谱后，如何从中重建出最佳的单一样品光谱？这是多光程方法的核心算法挑战。本研究创新性地提出了光程-噪声比（Pathlength-to-Noise Ratio, PNR）作为加权度量：

PNR后处理步骤。(a) 原始吸收光谱随光程变化的二维图（x轴：波数，y轴：光程/探测器元素编号）；(b) 各探测器元素在所有波数上的RMS噪声分布，显示短光程（低探测器编号）噪声较低，长光程（高探测器编号）因信号衰减导致噪声升高；(c) 基于RMS噪声计算的PNR分布，呈现中间光程区域PNR最优的特征；(d) 经PNR加权融合后重建的单一样品光谱，相较于简单平均或固定光程选择，显著改善了信噪比和光谱质量。

PNR算法的核心逻辑是：

l 信号强度与光程成正比（Lambert-Beer定律）——长光程提供更强的吸收信号；

l 噪声水平随光程增加而恶化——长光程下透射光强衰减，探测器信噪比下降；

l PNR = 信号 / 噪声——存在一个最优光程区间，使PNR达到最大值；

l 自适应加权——对每个波数、每个探测器元素的信号按PNR进行加权平均，最优光程的信号贡献最大，次优光程贡献递减，饱和或噪声过高的光程被自动抑制。

这一算法的关键优势在于自适应性和鲁棒性：不同波数处的最优光程可能不同（例如酰胺I区可能需要不同于酰胺II区的光程），PNR算法自动为每个波数选择最合适的加权组合，无需人工干预。

三、系统校准

(a) 不同浓度咖啡因（1–50 mg/mL）在乙醇中的吸收光谱随光程变化的二维图，展示了从短光程（低吸收，蓝色）到长光程（高吸收，红色）的渐变过程；(b) 基于咖啡因吸收光谱的光程校准结果，确定175 μm（对应探测器元素~190）为有效线性光程上限，超过此光程因过量吸收导致信号饱和和非线性。

为确保光程标定的准确性，研究使用咖啡因在乙醇中的溶液作为校准样品。咖啡因在~1650 cm⁻¹和~1550 cm⁻¹处具有强吸收带，其吸光度与浓度和光程均呈线性关系（Lambert-Beer定律）。

校准实验确定了系统的关键参数：光程线性范围：7.4–175 μm（对应探测器元素~1–190），在此范围内吸光度与光程严格线性；非线性阈值：超过175 μm（元素190），咖啡因的强吸收导致探测器信号饱和，线性关系破坏；PNR最优区：~50–150 μm光程范围内，PNR达到峰值，是蛋白质测量的最佳工作区间。

值得注意的是，尽管流通池的最大物理光程可达457.4 μm，但由于水的强吸收，>150 μm的光程在含水样品测量中因过量吸收而信号质量不佳。作者指出，未来的优化方向是将楔形腔的光程范围收窄至~150 μm以内，以获得更高的光程分辨率（更小的探测器间距对应更精细的光程步进）。

四、蛋白质测量验证

(a) 和 (c)：FTIR参考光谱，展示BSA的高α-螺旋含量（绿色谱线，酰胺I带中心~1658–1662 cm⁻¹）和β-乳球蛋白的高β-折叠含量（蓝色谱线）；(b) 和 (d)：EC-QCL多光程系统实测光谱，(b) 为不同浓度（1–50 mg/mL）BSA的吸收光谱，(d) 为不同浓度β-乳球蛋白的吸收光谱。两种蛋白质的酰胺I和酰胺II带均被清晰分辨，且BSA与β-乳球蛋白之间的谱带形状和位置差异一目了然，与其二级结构组成一致。

实验选用牛血清白蛋白（BSA，高α-螺旋结构）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，高β-折叠结构）作为模型蛋白质，浓度范围5–25 mg/mL。

结果表明：酰胺I带（~1658–1662 cm⁻¹）：BSA的中心频率高于β-乳球蛋白，反映了α-螺旋与β-折叠结构的不同氢键环境；酰胺II带（~1545–1555 cm⁻¹）：两种蛋白质均呈现清晰的吸收峰，位置差异与各自的氨基酸组成和二级结构相关；与FTIR参考光谱的一致性：EC-QCL多光程光谱的整体轮廓与FTIR高度吻合，证实了方法的可靠性；轻微差异：BSA的酰胺I带在EC-QCL光谱中略宽，并相对于FTIR谱有轻微红移，可能归因于评估算法和该区域较高的噪声水平。

五、检测限

基于各探测器元素的RMS噪声，研究分别计算了酰胺I区（1600–1700 cm⁻¹）和酰胺II区（1500–1600 cm⁻¹）的检测限（LOD，定义为3倍RMS噪声对应的浓度）：

酰胺II区的LOD优于酰胺I区，主要是因为酰胺II区的吸收信号更强（对于BSA而言），且水在该区域的吸收干扰相对较小。这些LOD值表明，当前系统已具备对数mg/mL级别蛋白质溶液进行结构鉴定的灵敏度，但在定量性能上仍有提升空间——未来可通过采用更高灵敏度的MCT或III-V超晶格探测器阵列、优化光程范围、以及改进PNR算法来进一步降低检测限。

六、技术定位

本研究的核心贡献在于：将EC-QCL的高光谱功率密度优势与楔形多光程流通池的空间编码能力相结合，首次实现了无需机械移动的水溶液蛋白质动态光程中红外光谱测量。 PNR加权算法的引入，使系统能够自适应地融合不同光程下的光谱信息，在水的强吸收背景中“提取”出蛋白质的特征信号。尽管当前系统的LOD（~2 mg/mL）与最先进的单光程EC-QCL平衡探测系统（~0.0025 mg/mL）仍有差距，但其独特的动态光程能力为处理吸收特性未知或变化剧烈的复杂样品（如不同浓度、不同基质的生物体液）提供了一种灵活的替代方案。

原文链接：https://doi.org/10.1177/00037028241308478